CLONAGEM DE SEQUÊNCIAS DE REPLICAÇÃO AUTÔNOMA (ARS) DE Trypanosoma cruzi

Santuza Maria Ribeiro Teixeira

Orientadora:Profa.Ana Clara Schenberg Frascino

Co-orientador:Prof. Spartaco Astolfi Filho

CLONAGEM DE SEQUÊNCIAS DE REPLICAÇÃO AUTÔNOMA (ARS) DE Trypanosoma cruzi

RESUMO

Visando a clonagem de sequêcias de replicação autônoma (ARS) de Trypanosoma cruzi, foram contruídos bancos de genes a partir do DNA total e do K-DNA do tripanosomatídeo,em Escherichia coli 5K, utilizando-se o vetor Yp328,derivado do plasmídeo pBR328,contendo o gene URA3 de levedura.

Populações de plasmídeos recombinantes de cada banco foram utilizados para tranformar Saccharomyces cerevisiae 9251-9B (ura3-52) e diversos clones URA⁺ foram obtidos.Plasmídeos isolados dos clones de levedura transformada e amplificados em E.coli HB101 foram analisados através de digestão com enzimas de restrição e hibridação com DNA de T.cruzi.

Os resultados demostraram que,de 4 plasmídeos analisados,2 contêm fragmentos de DNA nuclear (5,6 kb e 4,8 kb) e 2 contêm fragmentos de maxicírculo do K-DNA (2,0 kb e 2,2 kb) de T.cruzi. Os plasmídeos recombinantes isolados transformam linhagens de levedura ura3 com eficiência maior que o plasmídeo YRp7 ( que contêm o ARS1 cromossomal de levedura) e apresentam alta instabilidade nestas células.Estes resultados indicam que o DNA nuclear e o K-DNA de T.cruzi contêm seqüências que funcionam como ARS em S.cerevisiae.

Trabalhos posteriores deverão ser realizados no sentido de verificar se as seqüências clonadas são reconhecidas como origens de replicação em T.cruzi e,se for este caso,estes plasmídeos poderão ser utilizados para se desenvolver um sistema de transfomação genética de tripanosomatídeos.

ABSTRACT

In order to isolate autonomous replication sequences from Trypanosoma cruzi two tripanosomatid genomic banks,were construted in Escherichia coli 5K: one from total DNA and a second one from K-DNA.The vector Yp328,derived from the plasmid pBR328 and containing the yeast URA3 gene,was used in these constructions.

The recombinant plasmids isolated from each bank were used to transform Saccharomyces cerevisiae 9251-9B, a ura3-52 deletion mutant.Several URA⁺ clones were obtainedin each case.Plasmids subsequently isolated from the transformant yeast clones were amplified in E.coli HB101 and analysed through restriction enzyme digestions and southern blot hibridization with T.cruzi nuclear DNA fragments (5,6 kb and 4,8 kb) and the other two contained fragments of the maxicircle component of K-DNA (2,0 kb and 2,2kb).

The isolated recombinant plasmids are able to transform yeast strains with higher efficiency than the plasmid Yrp7 (wich contains the yeast chromosomal ARS1) and are autonomously maintained,with high mitotic instability, in the yeast cells.These results indicate that T.cruzi DNA contains sequences wich function as ARS elements in S.cerevisiae.

Further studies should be carried out to verify whether the isolated sequences can de recognized as replication origins in T.cruzi cells. If this is indeed true, these plasmids might possibly be employed to develop a tripanosomatid genetic transformation system.